近几年来，脑类器官（Brain organoids）的培养和研究一直是神经科学领域的一大热点，这项由胚胎干细胞（Human embryonic stem cell, hESCs）技术而发展起来的脑科学技术一经发表就吸引了无数实验室的目光。
要知道，无论是对于研究发育还是研究功能的脑科学实验室来说，多一份人脑组织样本往往就意味着文章能够提升一到两个档次，其意义自然不言而喻。
但如何获得人脑组织样品一直都是一个令大家十分头疼的大问题，一是因为器官伦理方面的问题，二则是人脑组织样品大多是经由家属同意后，医院在捐赠者死后获取的，这使得样品的质量往往大打折扣。
免疫荧光下的脑类器官组织切片
脑类器官培养技术的出现，给人脑组织样品难获取这一问题提供了一个十分光明的解决路径，特别是对于研究大脑发育的科学家来说，这简直就是一项专门为他们而开发的实验技术！
培养皿中的脑类器官
虽然脑类器官培养技术的前景是十分光明的，但是目前这一技术还有很大的局限性。经由人干细胞诱导分化的脑类器官能够在早期形成简单的分层结构，但却无法像正常人脑一样继续分化发育下去形成更复杂的多层细胞结构，其大小也一般仅有 5mm-1cm 左右，与正常大脑相差甚大。并且，脑类器官也极少生成小胶质细胞，而小胶质细胞对于神经元的成熟和突触的形成来说是必不可缺的一类细胞，其在大脑的发育成熟过程中扮演了极其重要的作用，这也使得目前的脑类器官分化还不够成熟。
另外，还有十分重要的一点，目前培养的脑类器官中几乎不出现功能性的血管网络，这使得培养到后期的脑类器官内部细胞无法获取到足够的养分和氧气，导致脑类器官从内部细胞开始凋亡坏死，极大影响了培养进程及可培养时间。可以说，微血管网络形成的问题成为了目前制约脑类器官培养技术发展的重大瓶颈之一。
本文发表由耶鲁大学 In-Hyun Park 团队发表于 naturemethods
面对这一难题，来自耶鲁大学 In-HyunPark 的实验团队找到了突破的办法，通过在培养的人皮层脑类器官（Humancortical organoids, hCOs）中异位表达 ETV2 转录因子，成功使其出现了复杂的功能性血管网络，这不仅使得具血管人皮层脑类器官（vascularized hCOs, vhCOs）出现了更复杂的分化结构，神经元细胞更加成熟，而且还首次在其中发现了血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）类似结构！
为了形成具血管人皮层脑类器官（vascularized hCOs, vhCOs），研究者首先发现，与为人血管内皮细胞形成高度相关的 ETV2 转录因子，将其过表达在已分化的神经细胞环境中，能够将人胚胎干细胞（humanembryonic stem cells, hESCs）诱导分化为内皮细胞（endothelial cells, ECs）。利用这一特点，在由人胚胎干细胞诱导形成的人皮层脑类器官（hCOs）中，研究者通过在培养第 18 天时向部分细胞（~20%）过表达 ETV2，成功形成了内皮细胞 Marker 阳性的微血管类似结构。
EVT2 诱导 hCOs 后产生具有功能性微血管结构的 vhCOs
为了检测这些微血管类似结构是否具有功能性，研究者又分别在培养第 30、70 天时，对 control hCOs 和 vhCOs 分别检测了新生血管 Marker CD31 的表达情况，结果表明 vhCOs 在 30 天已经有约 10% 区域 CD31 显示阳性，70 天时阳性区域达到约 40%，而 control hCOs 即使培养至 70 天也没有检测到 CD31 阳性(图4,a-b)。FITC 浸染实验也表明，血管内皮细胞 Marker CD31 与 CDH5 阳性细胞区域能够使得外界环境中的 FITC 进入到类器官内部，进一步说明了新生微血管类似结构的功能性(图4,c)。
vhCOs 相比传统 hCOs 能够产生更多神经细胞
得益于为微血管结构的形成，脑类器官内部细胞能够获得更多的氧气及养分，vhCOs 在培养第 30 天时组织直径显著大于 controlhCOs，且在第 70 天及第 120 天时，vhCOs 细胞的 HIF-1 （没错，就是前几天那个获得诺奖的明星分子！）表达量和细胞细胞死亡率均极显著低于 control hCOs (图5，e-f)。
值得注意的是，在第 80 天时，vhCOs 中8/20（8 of20）的细胞能够产生动作电位，而 control hCOs 中仅有1/20 (图5，g-h)。这也就意味着，vhCOs 中的神经细胞不仅存活率要较 control hCOs 更高，而且具有功能的神经细胞数量也要比 control hCOs 中更多！
vhCOs 及 hCOs 单细胞转录组测序分析
研究者还对培养至第 70 天时的 vhCOs 及 control hCOs 分别进行了单细胞转录组测序，结果表明在 vhCOs 中大量血管生成因子、周皮细胞 Marker、胶原基因以及细胞粘附相关基因出现高表达，而在 control hCOs 则缺少这些基因的表达(图6，a-f)。
更为关键的是，转录组数据还表明 vhCOs 中的神经细胞在同一时间点总是要比 control hCOs 中的细胞更加成熟(图6，g-h)。这一数据充分说明了 ETV2 的过表达，使得 vhCOs 中的部分细胞被诱导向血管内皮相关细胞类型方向进行分化。
vhCOs 相较 hCOs 高表达紧密连接及胶质细胞 Marker
更为神奇的是，在 vhCOs 中部分特殊的内皮细胞还形成了神经周血管丛，并且还与脑内的神经血管紧密相连（tight junction），其性质十分类似于血脑屏障结构。在培养至 70 天时的 vhCOs 脑室腔结构中，发现了 -ZOD1，occlundin（OCLN），KDR 出现高表达（紧密连接 Marker）(图6，a-b,d)。并且，在 vhCOs 中还发现了 GFAP 及 S100 的表达，表明了胶质细胞的存在(图6，c)。
而在功能方面，通过跨内皮阻抗（trans-endothelial electrical resistance, TEER）分析表明，第 30 天及第 70 天时的 vhCOs 的 TEER 均显著性高于 control hCOs，且其在三维结构上 TEER 阻值十分接近于人血脑屏障 TEER 阻值(图6，e-f)。这些证据均说明 ETV2 诱导形成的 vhCOs 中的出现了与人血脑屏障十分类似的结构。
vhCOs 具有高 TEER 性质且对 1-42-oligo 敏感
特别地，研究团队还将 vhCOs 作为模型研究了A 1-42-oligo 及A 1-42-fibril 对于脑类器官的影响，结果表明添加A 1-42-oligo 后 FITC 浸染阻值面积出现减少，且 -ZO1 通路也出现下调，而添加了A 1-42-fibril 的实验组则未出现这一现象(图8，g)。该结果与之前A 1-42的累积会损害紧密连接并损伤血脑屏障的前期研究结果十分类似，初步阐明了将 vhCOs 作为未来 AD 研究新模型的可行性。
vhCOs 在体内培养依然具有功能性微血管结构
为更进一步探究 vhCOs 新生微血管组织的功能性，研究团队将培养的 vhCOs 与 control hCOs 分别移植进入了同一只小鼠的左右大腿肌肉中，在移植后第 10 天和第 30 天进行 MRI 检测及 FITC 及 hCD31 注射实验，结果表明移植后的 vhCOs 在小鼠肌肉中存活得十分不错，MRI 在第 10 天及第 30 天均能观察到其组织结构，而相对的，control hCOs 则无法用 MRI 检测到(图9，a-c)。FITC 级 hCD31 注射结果更进一步表明了，仅有 vhCOs 在移植后出现了功能性的微血管网络(图9，d-e)。
总结
In-Hyun Park 团队在这一篇文章利用 ETV2 这一转录因子，首次成功在脑类器官中形成了微血管网络及类血脑屏障结构，这极大提升了脑类器官的培养成熟度及分化程度，同时也解决了该领域的一个老大难问题，相信未来脑类器官的培养技术很快就将会有惊人的发展！
编译作者：Kagami（brainnews 创作团队）
