纪念斯隆 凯特琳癌症中心（MSKCC）和 GRAIL 联合研究团队，今天带来一项重要研究成果。
这项由 MSKCC 实验病理学主任 Jorge Reis-Filho 和临床医学科学家 Pedram Razavi 共同领导的研究，对 124 例癌症患者的 cfDNA、肿瘤组织样本和白细胞 DNA，以及 47 名无癌志愿者的 cfDNA 和白细胞 DNA，进行了超高深度测序（60000 ）。
他们发现，肿瘤患者血液 cfDNA 中携带的大部分基因突变，可能不是来自于癌细胞，而是血液中白细胞。
具体说来，在癌症患者的 cfDNA 中，克隆性造血带来的变异可能占 53.2%；而在健康的志愿者体 cfDNA 中，这一数字能达到 81.6%。这意味着，克隆造血带来的突变比科学家原来认为的要常见的多。
看到这个结果，我们差点儿从椅子上掉下去。 Reis-Filho 说。
这也给液体活检相关的研究提出了挑战，在给患者开展液体活检时，白细胞 DNA 应该是必检项目，甚至需要开展超高深度的测序。
Pedram Razavi、David N. Brown 和华人科学家 Bob T. Li 是共同第一作者。研究论文发表在顶级期刊《自然 医学》上。
从左到右：Pedram Razavi，Jorge Reis-Filho，Bob Li（图源：MSKCC）
我们都知道，随着人体各种细胞的死亡破裂，细胞的 DNA 会释放到血液中，这些 DNA 就构成循环游离 DNA（cfDNA）。同理，肿瘤细胞也会死亡，并往血液中释放游离 DNA，这就是我们所熟悉的循环肿瘤 DNA（ctDNA）。很显然，ctDNA 只是 cfDNA 中带有基因变异的那一小部分。
ctDNA 的发现，让科学家对癌症的液体活检技术寄予厚望。
虽然科学家想到了很多方法研究 ctDNA，但是仍难摆脱多种混杂因素的影响。
其中影响比较大的一个是克隆性造血。
克隆性造血是那些有基因突变的造血干细胞，通过多系造血分化，形成携带同样突变的终末分化成熟血细胞。虽然其中一些突变会导致后代血细胞具备适应性优势，出现不成比例的扩增，但是这种克隆性扩增并不是恶性的。
克隆性造血会随着年龄的增长而增加，之前有研究表明31% 的老年人都会出现克隆性造血。而且，导致克隆性造血的基因突变，也可以通过 cfDNA 检测到。
Reis-Filho 等认为，克隆性造血肯定会影响肿瘤学家对 cfDNA 测序结果的解释，尤其是很大一部分 cfDNA 片段源自造血细胞。
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尽管大量的研究表明，通过 cfDNA 检测到的基因突变，与通过肿瘤组织检测到的基因突变有很好的一致性。不过，还是有科学家在 cfDNA 中发现了很多肿瘤组织中不存在的基因突变。当然啦，这部分突变有可能是因为组织活检取样的不全面带来的，也有可能是克隆性造血导致的。
关于这个问题，Reis-Filho 等认为需要好好研究一番。
在 2015 年 9 月到 2016 年 8 月之间，研究人员一共招募了 124 名晚期未经治疗或者进行性转移的癌症患者，其中乳腺癌（MBC）患者 39 名，非小细胞肺癌（NSCLC）患者 41 名，前列腺癌（CRPC）患者 44 名。另外还招募了 50 名没有癌症的志愿者，作为对照样本，不过最终只有 47 名无癌志愿者的样本有评估价值。
研究人员从癌症患者身上获取了肿瘤组织样本、cfDNA 和白细胞 DNA，从无癌志愿者身上获取了 cfDNA 和白细胞 DNA 样本。
获取样本之后，他们基于已经获得 FDA 批准的 MSK-IMPACT 平台，给每个样本独立开展了深度高达 60000 的测序（这个测序深度，成本该有多高 ）。
实验流程图
从总体上看，基于肿瘤组织的活检发现了 740 个突变，基于 cfDNA 的检测包含其中的 530（71.6%）。具体到各个癌种的话，比例也是类似的，乳腺癌 72%，非小细胞肺癌和前列腺癌是 71%。
而且，在 cfDNA 发现的基因突变中，有一些突变虽然在肿瘤组织检测中出现，但是频率极低，还有一些在肿瘤组织和白细胞中均没有出现过（研究人员把它们叫做 VUSOs）。
在确定了他们这个高深度测序方法的准确性和敏感性之后。研究人员推测，那些在肿瘤组织和白细胞中均没有出现过突变，可能反应了肿瘤的进化和异质性。而携带这部分变异的肿瘤组织，可能没有被活检采集到。
通过以上数据，我们不难发现，cfDNA 检测和基于组织的活检还是存在一定的差异的。
cfDNA 检测的主要基因突变分析
紧接着，研究人员又开展了一项探索性分析：是否可以通过 cfDNA 评估 TMB、肿瘤突变特征和 MSI。
分析发现，肿瘤组织活检发现了6 个高 TMB 的样本，其中 4 例样本也被 cfDNA 判定为有高 TMB。不过，cfDNA 还判定另外 6 个样本为高 TMB 样本，但是肿瘤组织检测结果不支持 cfDNA 的结果。
在 cfDNA 确定的 10 个高 TMB 样本中，有 75% 的突变是在肿瘤组织中出现频率低，以及在肿瘤组织和白细胞中均没有出现过的。据此，研究人员进一步推测，这可能确实是肿瘤的空间异质性导致的，它们只在一些部位出现超突变，而这个部位恰恰没有被组织活检取到样。随后的基因分析也从侧面佐证了上述结果。
总结以上数据，研究人员认为，cfDNA 测序可以准确检测整个肿瘤基因组中很大一部分的突变，或许可以反映患者肿瘤的 TMB、肿瘤突变特征和 MSI。而且，cfDNA 可以检测到肿瘤组织活检发现不了的亚克隆突变。
TMB 分布图
随后，研究人员又分析了 cfDNA 检测到的突变生物学来源。在无癌的志愿者样本中，cfDNA 检测到的突变（364），有 81.6%（297）出现在了白细胞 DNA 中；而在癌症患者群体中，cfDNA 检测到的 1727 个突变，有 53.2%（918）出现在了白细胞 DNA 中。
并且通过一系列的分析，研究人员认为，通过 cfDNA 进行超高深度测序发现的基因突变，不太可能是技术本身带来的假阳性。而且，之前研究中开展的的白细胞 DNA低深度测序，可能大大低估了克隆性造血的普遍程度。
总之，在 Reis-Filho 团队看来，他们提出的这种超高深度 cfDNA 测序分析，确定克隆性造血突变是 cfDNA 中非肿瘤突变的最可能来源。而且这个比例相当惊人，至少在这个研究中，93. 6% 的无癌志愿者的白细胞携带一个克隆性造血突变，而这一比例在癌症患者群体中竟高达 99.1%。
实验设计过程图
最后，论文作者在文章的讨论部分指出了一个有趣的现象。他们认为，当前大多数临床的 cfDNA 检测，都没有同时检测白细胞的 DNA。结合着这个研究成果来看，这种不同时检测白细胞 DNA 的做法，肯定是不合适的。
不过，我今天特地了解了几个国内头部肿瘤测序公司的情况，基本都在检测 cfDNA 的同时，检测了白细胞的 DNA，只是测序深度远低于 MSKCC 这个研究。
无论如何，这个研究一方面证明了 cfDNA 检测相较于组织活检的优点，另一方面也警示相关研究人员，在检测 cfDNA 的同时，一定要检测白细胞的 DNA，最好是超高深度测序。
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作者：BioTalker
